CNBr活化的瓊脂糖在制備和使用定制親和色譜填料方面具有良好的記錄。將生物特異性配體與CNBr活化的瓊脂糖偶聯(lián)是一項廣泛使用、成功且有據(jù)可查的技術(shù)。偶聯(lián)反應(yīng)是自發(fā)的、快速的并且易于進(jìn)行。不需要有毒化學(xué)品或特殊制備。

這種預(yù)活化的瓊脂糖基質(zhì)可以很容易地用于制造各種親和色譜填料，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。應(yīng)用領(lǐng)域包括蛋白質(zhì)、多肽和核酸的固定化。

1.屬性

CNBr活化瓊脂糖色譜填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機(jī)械剛度，可在降低背壓的情況下實現(xiàn)高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。

基礎(chǔ)基質(zhì)與溴化氫（CNBr）反應(yīng)生成活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)與待固定分子中的伯胺基團(tuán)反應(yīng)。CNBr活化瓊脂糖色譜填料(CNBr-activated SepFast)以添加添加劑的凍干粉形式提供。

表1  CNBr活化瓊脂糖色譜填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)的特性

2.配體固定化

以下是配體一般的偶聯(lián)流程。

2.1    將目標(biāo)配體溶解在含有0.5 M  NaCl的0.1 M  NaHCO3，pH  8.3的偶聯(lián)緩沖液中。對于蛋白質(zhì)配體，凝膠濃度為5 - 20  mg/ml。對于小配體，制作1 - 10µmol/ml凝膠。偶聯(lián)緩沖液的體積應(yīng)與固定凝膠的體積相同。

2.2  稱取所需的粉末（1 g干粉提供約9 ? 12 ml的沉降填料）并將其懸浮在預(yù)冷的 1 mM  HCl中（1 g 干粉使用20  ml預(yù)冷的1 mM  HCl）。讓填料在低溫下膨脹2  -  3分鐘。

2.3   快速去除過濾裝置中的液體。

2.4  將洗凈吸干的凝膠轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)緩沖液中。

2.5  漿液在4℃下混合過夜或在室溫下混合3-4小時。

2.6  用至少5 倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠。

2.7 將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液中，0.1 M Tris/HCl，pH  8.0 或1  M  乙醇胺 pH  8.0，持續(xù)2 - 3小時。

2.8 用5倍體積的0.1 M 0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3.固定化效率的一般考慮

3.1 pH

pH 8.3的緩沖液常用于蛋白質(zhì)固定。然而偶聯(lián)pH值可在6-10之間進(jìn)行優(yōu)化以獲得最佳結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。

注意：配體溶解后要調(diào)節(jié)偶聯(lián)pH值。

3.2 偶聯(lián)方案

應(yīng)避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性。

3.3 鹽

偶聯(lián)緩沖液中鹽的存在可以提高固定效率。

3.4 基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化基團(tuán)

對于某些配體或應(yīng)用，基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化水平可能過高，偶聯(lián)配體的活性可能會降低。

在降低的pH值下偶聯(lián)可能會減少配體分子的連接點。它可以提高偶聯(lián)配體的活性?；罨鶊F(tuán)的受控水解，例如在添加配體前幾個小時用偶聯(lián)緩沖液孵育凝膠，也可以減少過度偶聯(lián)問題。

3.5 屏蔽剩余的活化配體

未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)通過添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如Tris或乙醇胺）來封端。

3.6 最終填料的洗滌

偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。

4.固定化親和填料的使用

配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。

5.儲存

凍干的CNBr活化瓊脂糖色譜填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)應(yīng)在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合填料。

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