羧基活化的瓊脂糖可用于固定含胺分子。耦合化學(xué)是基于碳二亞胺的，是一項(xiàng)成功且有據(jù)可查的技術(shù)。

羧基活化瓊脂糖色譜填料(Carboxyl-activated SepFast)與含有伯胺基團(tuán)的配體形成化學(xué)穩(wěn)定的酰胺鍵，它有一個(gè)長間隔區(qū)（9個(gè)原子）。預(yù)活化的瓊脂糖基質(zhì)可以用于制作各種定制的親和色譜填料，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。

1. 屬性

羧基活化瓊脂糖色譜填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機(jī)械剛度，可在降低背壓的情況下實(shí)現(xiàn)高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。

通過將長的親水性間隔臂連接到骨架上來活化基礎(chǔ)基質(zhì)。它直接與分子中的伯胺基反應(yīng)，在碳二亞胺試劑存在下被固定。羧基活化瓊脂糖色譜填料(Carboxyl-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。

表1  羧基活化瓊脂糖色譜填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)的特性

2. 配體固定化

以下是配體一般的偶聯(lián)流程。

2.1  將目標(biāo)配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中，將pH值調(diào)整為4.5。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。

2.2  在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗羧基活化凝膠。

2.3  將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟 2.2）轉(zhuǎn)移到步驟2.1 制備的溶液中。

2.4  將碳二亞胺作為干粉或預(yù)先溶解的溶液添加到漿液中，最終濃度為0.1 M。如果碳二亞胺預(yù)先溶解在水中，則將pH值調(diào)整為4.5。

2.5  在室溫或4-8℃下混合漿料。

2.6   在第1個(gè)小時(shí)內(nèi)通過添加 0.1  M NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值至4.5。

2.7 將偶聯(lián)反應(yīng)放置2-24小時(shí)。

2.8 用5倍體積的0.1 M 醋酸鹽緩沖液 + 0.5 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠。重復(fù)上述洗滌2次以上。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

偶聯(lián)反應(yīng)在pH 4.5 - 7.5之間非常有效地進(jìn)行。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)pH以獲得最佳結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。

在偶聯(lián)反應(yīng)的第1個(gè)小時(shí)內(nèi)，pH值會(huì)降低。要記得通過添加0.1 M NaOH來調(diào)節(jié)偶聯(lián)pH值。之后pH值會(huì)趨于穩(wěn)定。

3.2 偶聯(lián)方案

去離子水可直接用作偶聯(lián)溶液。應(yīng)避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與配體偶聯(lián)發(fā)生競爭。

可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性。

3.3 碳二亞胺的選擇

應(yīng)使用水溶性碳二亞胺，例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺  (EDC)  或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基) 碳二亞胺  (CMC)（通常合成為 metho?p?甲苯磺酸鹽）。EDC是常用的碳二亞胺試劑。

3.4 碳二亞胺的濃度

添加的碳二亞胺的量應(yīng)以化學(xué)計(jì)量的方式超過活化的羧基。建議以最終反應(yīng)漿料中的0.1  M作為起點(diǎn)。

3.5 反應(yīng)時(shí)間和溫度

可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化填料之間的接觸時(shí)間以保持配體的生物活性。

典型的反應(yīng)時(shí)間是在室溫或冷藏室中過夜。

3.6 屏蔽剩余的活化配體

如果加入過量的配體，則可能不需要封閉殘留的活化基團(tuán)。

未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)在碳二亞胺存在下通過添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如1 M乙醇胺）來封端。

3.7 最終填料的洗滌

偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。

4. 固定化親和填料的使用

配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。

5. 儲(chǔ)存

羧基活化瓊脂糖色譜填料(Carboxyl-activated SepFast)應(yīng)在8℃下儲(chǔ)存。偶聯(lián)的濕填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲(chǔ)存。切勿凍存耦合填料。

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