PCR作為分子生物學(xué)中常用的技術(shù)之一，目的是通過引物的作用擴增DNA序列。那PCR引物設(shè)計的時候，應(yīng)該注意哪些問題呢？

一、引物設(shè)計區(qū)域：最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

二、引物設(shè)計長度：15~30bp最you

引物長度(primer length)常用的是18~27 bp,但不應(yīng)大于38,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。

三、引物GC含量：40%~60%，Tm值≈72℃。

GC含量(composition)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

四、引物3'端：避開密碼子的第3位

如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

五、引物3'端：不能選擇A,最好選擇T

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇T。

六、堿基分布：隨機分布

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3′端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)(False priming)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

七、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列

引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應(yīng)具有互補性，尤其應(yīng)避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal/mol)。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。

八、引物5'端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3'端△G值較低

△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5'端和中間△G值相對較高，而3'端△G值較低(絕對值不超過9)的引物。引物3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。  (不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析)

九、引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾

引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地gao辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。

十、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)

某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件(比如RNAstructure)可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能(△G°)小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

十一、引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做Real Time時，用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：

(1)避免重復(fù)堿基，尤其是G。

(2) Tm=58-60度。

(3)GC=30-80%。

(4)3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C。

(5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。

(6)PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適(可以延長至300 bp)。

(7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

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