蛋白表達實驗的時,有時候實驗會覺得參考實驗方法和克隆的蛋白基因序列完q沒有問題,但蛋白電泳就是沒有結果。那么你知道蛋白表達的常見問題有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!
1、載體構建錯誤,很多克隆新人常常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體,其復制位點常有一兩個堿基的差異;另外有些酶產生粘端有些酶產生平端,這些都容易導致讀碼框錯誤,從而無法表達出來。
2、宿主菌選擇不當。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些經過特殊修飾的載體,或者特殊用途的載體,或者有特殊啟動子的載體,必須選擇適合的宿主菌進行表達。因此,當你的蛋白沒有表達出來時,可以考慮更換宿主菌。
3、密碼子的使用頻率較低。有些基因其本身含有許多罕見密碼子,尤其是起始密碼之后的15個堿基之內的罕見密碼子,對蛋白表達有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達似乎效果很好,對真核表達系統(tǒng)未必有很好的效果。
4、質粒不穩(wěn)定或者質粒丟失。pET系統(tǒng)通常相對較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時,也許有可能產生β-lactamase降解了抗生素,使質粒丟失。還有一種情況是表達重組的毒素蛋白,對宿主細胞也具有毒性,導致質粒丟失。這種情況在真核表達系統(tǒng)中較為常見。
5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況通常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起。當蛋白N-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr這些氨基酸時,容易受到蛋白酶降解,這就是所謂的N-末端規(guī)則。如果N-端是Met時,大腸桿菌可以偷偷地將這個Met去掉,尤其是Met之后緊跟著一個帶有小側鏈的氨基酸時。而C-末端存在非極性氨基酸時,也容易導致蛋白被降解。如果C末端最后5個氨基酸是極性的或者帶電荷的,則不容易被降解。
6、二級翻譯起始位點。這種情況出現在你的序列中恰好包含與核糖體結合位點完q相同的序列。那就怪不得了,核糖體會非常高興地找到這個位點,然后開始翻譯,導致你的蛋白被截短,在電泳時無法看到預期大小的片段。
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